Flyvetidsmassespektrometri

Laserionisert flyvetidsmessespektrometer hvor ionene er akselerert og separert ved masse

Bendix MA-2 flyvetidsmassespektrometer fra 1960 tallet

Flyvetidsmassespektrometri (engelsk Time-of-flight mass spectrometry (TOFMS)) er en metode innenfor massespektrometri hvor ionets masse-til-ladningsforhold er bestemt på bakgrunn av hvor lang tid ionet bruker på å bevege seg en gitt distanse. Ionene er akselerert ved hjelp av et elektrisk felt med en gitt styrke. Denne akselerasjonen vil resultere i at ionet får samme kinetiske energi som alle andre ioner med samme ladning. Farten til ionet kommer av masse-til-ladningsforholdet (tyngre ioner med samme ladning vil oppnå lavere hastighet). Den tiden det tar for ionet å nå detektoren er en kjent avstand, tiden ionet bruker er avhengig av hastigheten. Fra dette forholdet og kjente eksperimentelle parametre kan en identifisere ionet.

Teori

Figur fra William E. Stephens 1952 TOF patent.

Den potensielle energien til en ladet partikkel i et elektrisk felt er relatert til ladningen av partikkelen og styrken til det elektriske feltet:

$E_{\mathrm {p} }=qU\,$

hvor E_p er potensiell energi, q er ladningen til partikkelen, og U er den elektriske potensialforskjellen (også kjent som spenning).

Når den ladede partikkelen akselereres til flyvetidsrøret (TOF-rør eller flyrør) av spenningen U, omdannes dens potensielle energi til kinetisk energi. Den kinetiske energien til en hvilken som helst masse er:

$E_{\mathrm {k} }={\frac {1}{2}}mv^{2}$

I virkeligheten konverteres den potensielle energien til kinetisk energi, noe som betyr at ligningene ovenfor er like, det vil si:

$E_{\mathrm {p} }=E_{\mathrm {k} }\,$

$qU={\frac {1}{2}}mv^{2}\,$

Hastigheten til den ladede partikkelen etter akselerasjon vil ikke endres siden den beveger seg i et feltfritt flyrør. Partikkelens hastighet kan bestemmes i et flyvetidsrør siden lengden på veien (d) for ionets flyging er kjent, og tidspunktet for ionens flyging (t) kan måles ved hjelp av en forbigående digitaliser eller tid til digital omformer.

Dermed,

$v={\frac {d}{t}}\,$

og vi erstatter verdien av v

$qU={\frac {1}{2}}m\left({\frac {d}{t}}\right)^{2}\,$

Omorganisering ligningen ovenfor slik at flytiden uttrykkes av alt annet:

$t^{2}={\frac {d^{2}}{2U}}{\frac {m}{q}}\,$

Ved å ta kvadratroten gir tiden,

$t={\frac {d}{\sqrt {2U}}}{\sqrt {\frac {m}{q}}}\,$

Disse faktorene for flytiden er gruppert med vilje. ${\frac {d}{\sqrt {2U}}}$ inneholder konstanter som i prinsippet ikke endrer seg når et sett med ioner analyseres i en enkelt akselerasjonspuls. Ligningen for tiden kan således gis som:

$t=k{\sqrt {\frac {m}{q}}}\,$

hvor k er en proporsjonalitetskonstant som representerer faktorer relatert til instrumentinnstillinger og egenskaper.

Denne ligningen avslører tydeligere at flytiden for ionet varierer med kvadratroten av dets masse-til-ladningsforhold (m/q).

Tenk på et eksempel fra den virkelige verden på et MALDI massespektrometerinstrument med flytid som brukes til å produsere et massespektrum av de tryptiske peptidene i et protein. Anta at massen av ett tryptisk peptid er 1000 dalton (Da). Den typen ionisering av peptider produsert av MALDI er vanligvis +1 ioner, så q = e i begge tilfeller. Anta at instrumentet er satt til å akselerere ionene i et potensial på U = 15 000 volt (15 kilovolt eller 15 kV). Anta at lengden på flyrøret er 1,5 meter (typisk). Alle faktorene som er nødvendige for å beregne ionenes flygingstid er nå kjent, som først blir evaluert av ionet med masse 1000 Da:

$t={\frac {1.5\;\mathrm {m} }{\sqrt {2(15000\;\mathrm {V} )}}}{\sqrt {\frac {(1000\;\mathrm {Da} )(1.660538921\times 10^{-27}\;\mathrm {kg\;Da} ^{-1})}{+1.602\times 10^{-19}\;\mathrm {C} }}}$

Merk at massen måtte konverteres fra dalton (Da) til kilogram (kg) for å gjøre det mulig å evaluere ligningen i de riktige enhetene. Den endelige verdien skal være i sekunder:

$t=2.792\times 10^{-5}\;\mathrm {s}$

som er omtrent 28 mikrosekunder. Hvis det var et enkelt ladet tryptisk peptidion med 4000 Da-masse, og det er fire ganger større enn 1000 Da-massen, ville det ta to ganger tiden, eller omtrent 56 mikrosekunder å krysse flyrøret, siden tiden er proporsjonal med kvadratroten til forholdet mellom masse og ladning.

Forsinket utvinning

Masseoppløsningen kan forbedres i aksialt MALDI-TOF massespektrometer der ioneproduksjon finner sted i vakuum ved å la den innledende utbruddet av ioner og nøytraler produsert av laserpulsen få likevekt og la ionene bevege seg med litt avstand vinkelrett på prøveplaten før ioner kan akselereres i flyrøret. Ionelikevekten i plasmasøylen produsert under desorpsjonen/ioniseringen skjer omtrent 100 ns eller mindre, etter at de fleste ioner uansett masse begynner å bevege seg fra overflaten med en gjennomsnittlig hastighet. For å kompensere for spredningen av denne gjennomsnittlige hastigheten og for å forbedre masseoppløsningen, ble det foreslått å forsinke ekstraksjonen av ioner fra ionekilden mot flyrøret med noen hundre nanosekunder til noen mikrosekunder med hensyn til begynnelsen av en kort (vanligvis, noen få nanosekunder) laserpuls. Denne teknikken blir referert til som "tidsforsinkelsesfokusering" for ionisering av atomer eller molekyler ved resonansforbedret multifotonionisering eller ved elektronpåvirkningionisering i en fortynnet gass og "forsinket ekstraksjon" for ioner produsert generelt ved laserdesorpsjon/ionisering av molekyler adsorbert på flate overflater eller mikrokrystaller plassert på ledende flate overflate.

Forsinket ekstraksjon refererer vanligvis til driftsmodus for vakuumionkilder når begynnelsen av det elektriske feltet som er ansvarlig for akselerasjon (ekstraksjon) av ionene i flyrøret er forsinket med en kort tid (200–500 ns) med hensyn til ionisering ( eller desorpsjon/ionisering). Dette skiller seg fra et tilfelle med konstant ekstraksjonsfelt der ionene akselereres øyeblikkelig etter at de er dannet. Forsinket ekstraksjon brukes med MALDI eller laserdesorpsjon/ionisering (LDI) ionekilder der ionene som skal analyseres produseres i en ekspanderende puls som beveger seg fra prøveplaten med høy hastighet (400–1000 m/s). Siden tykkelsen på ionepakkene som kommer til detektoren er viktig for masseoppløsningen, kan den ved første øyekast virke kontraintuitiv for å la ioneflukten utvide seg ytterligere før ekstraksjon. Forsinket ekstraksjon er mer en kompensasjon for ionens innledende bevegelsesmengde: det gir de samme ankomsttidene til detektoren for ioner med samme masse-til-ladningsforhold, men med forskjellige starthastigheter.

Ved forsinket ekstraksjon av ioner produsert i vakuum begynner ionene som har lavere bevegelsesmengde i ekstraksjonsretningen å bli akselerert ved høyere potensial på grunn av å være lenger fra ekstraksjonsplaten når ekstraksjonsfeltet er slått på. Omvendt begynner disse ionene med større fremdrift å bli akselerert ved lavere potensial siden de er nærmere ekstraksjonsplaten. Ved utgangen fra akselerasjonsområdet vil de langsommere ionene på baksiden av søylen bli akselerert til større hastighet enn de opprinnelig raskere ionene på fronten av søylen. Så etter forsinket ekstraksjon har en gruppe ioner som forlater ionekilden tidligere lavere hastighet i akselerasjonsretningen sammenlignet med en annen gruppe ioner som forlater ionkilden senere, men med større hastighet. Når ionekildeparametere er riktig justert, fanger den raskere gruppen av ioner opp til den langsommere i en viss avstand fra ionekilden, slik at detektorplaten plassert på denne avstanden oppdager samtidig ankomst av disse gruppene av ioner. På sin måte fungerer den forsinkede anvendelsen av akselerasjonsfeltet som et endimensjonalt flyvetidsfokuseringselement.

Reflektron

Et reflektron med to trinn fra et Shimadzu IT-TOF-instrument. De 46 metallplatene bærer spenningene som setter opp en potensiell gradient.

Reflektron flyvetidsmassepsektrometer skjematisk

Den kinetiske energifordelingen i retning av ioneflyging kan korrigeres ved hjelp av en reflektron. Reflektronen bruker et konstant elektrostatisk felt for å reflektere ionestrålen mot detektoren. De mer energiske ionene trenger dypere inn i reflektronen, og tar en litt lengre vei til detektoren. Mindre energiske ioner av samme masse-til-ladningsforhold trenger en kortere avstand inn i reflektronen og tar tilsvarende en kortere vei til detektoren. Den flate overflaten til ionedetektoren (vanligvis en mikrokanalplatedetektor, MCP) er plassert på et plan der ioner med samme m/z, men med forskjellige energier, ankommer samtidig telles med hensyn til begynnelsen av ekstraksjonspulsen i ionekilden . Et punkt med samtidig ankomst av ioner med samme masse-til-ladnings-forhold, men med forskjellige energier, blir ofte referert til som flyvetidsfokus. En ytterligere fordel med re-TOF-arrangementet er at to ganger flyveien oppnås i en gitt lengde på flyvetidsinstrumentet.

Ionegating

En Bradbury-Nielsen-lukker er en type ioneport som brukes i flyvetidsmassespektrometre og i ionmobilitetsspektrometre, samt Hadamard-transformasjon av flyvetidsmassespektrometre. Bradbury-Nielsen-lukkeren er ideell for hurtig tidsbestemt ionevalg (TIS) - en enhet som brukes til å isolere ioner over smalt masseområde i tandem (TOF/TOF) MALDI-massespektrometre.

Orthogonal akselerasjon flyvetid

Agilent 6210 elektrospray-ionisering ortogonal massespektrometer (høyre) og HPLC (venstre)

Ortogonal akselerasjonstid for flymassespektrometer skjematisk: 20 - ionekilde; 21 - ionetransport; 22 - flyrør; 23 - isolasjonsventil; 24 - repellerplate; 25 - rutenett; 26 - akselerasjonsregion; 27 - reflektron; 28 - detektor.

Kontinuerlige ionekilder (oftest elektrosprayionisering, ESI) blir vanligvis grensesnittet til flyvetidsmasseanalysatoren ved "ortogonal ekstraksjon" der ioner som blir introdusert i flyvetidsmasseanalysatoren, akselereres langs aksen vinkelrett på deres opprinnelige bevegelsesretning. Ortogonal akselerasjon kombinert med kollisjonell ionekjøling gjør det mulig å skille ioneproduksjonen i ionekilden og masseanalyse. I denne teknikken kan veldig høy oppløsning oppnås for ioner produsert i MALDI- eller ESI-kilder. Før du går inn i det ortogonale akselerasjonsområdet eller pulsereren, blir ionene produsert i kontinuerlige (ESI) eller pulserte (MALDI) kilder fokusert (avkjølt) til en stråle med en diameter på 1–2 mm ved kollisjoner med en restgass i RF-multipol guide. Et system med elektrostatiske linser montert i høyt vakuumområde før pulsereren gjør strålen parallell for å minimere dens avvik i akselerasjonsretningen. Kombinasjonen av ionekollisjonskjøling og ortogonal akselerasjon flyvetidsmassespektrometeret har gitt betydelig økning i oppløsningen av moderne flyvetidsmassespektrometre fra noen få hundre til flere titusenvis uten å kompromittere følsomheten.

Tandem flyvetidsmassespektrometer

I en TOF/TOF akselereres ioner til den første TOF og massen overført til en kollisjonscelle; fragmentioner skilles i den andre TOF.

Tandem flyvetidsmassespektrometer (TOF/TOF) er en tandem massespektrometri-metode der to flyvetidsmassespektrometre brukes fortløpende. For å registrere hele spekteret av forgjenger (foreldre) ioner, fungerer TOF/TOF i MS-modus. I denne modusen velges energien til pulslaseren litt over begynnelsen av MALDI for spesifikk matrise i bruk for å sikre kompromisset mellom et ionutbytte for alle foreldreionene og redusert fragmentering av de samme ionene. Når du opererer i en tandem (MS/MS)-modus, økes laserenergien betydelig over MALDI-terskelen. Det første TOF-massespektrometeret (i utgangspunktet et flyrør som ender opp med den tidsbestemte ionevelgeren) isolerer valgfrie forløperioner ved hjelp av et hastighetsfilter, typisk av Bradbury–Nielsen-typen, og den andre TOF-MS (som inkluderer post akselerator, flyrør, ionespeil og ionedetektor) analyserer fragmentionene. Fragmentioner i MALDI TOF/TOF er et resultat av forfall av forløperioner som er vibrasjonelt begeistret over deres dissosieringsnivå i MALDI-kilde. Ytterligere ionefragmentering implementert i en høyenergisk kollisjonscelle kan tilsettes systemet for å øke dissosieringshastigheten for vibrasjonseksiterte forløperioner. Noen design inkluderer forgjengersignaldempere som en del av andre TOF-MS for å redusere øyeblikkelig strømbelastning på ionedetektoren.